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規(guī)范操作讓熒光光度計發(fā)揮實效

更新時間:2021-12-17      點擊次數(shù):878
  熒光光度計是用于掃描液相熒光標記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù),從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過對這些參數(shù)的測定, 不但可以做一般的定量分析, 而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化, 從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。熒光分光光度計的激發(fā)波長掃描范圍一般是190~650nm,發(fā)射波長掃描范圍是200~800nm??捎糜谝后w、固體樣品(如凝膠條)的光譜掃描。
 
  熒光光度計的操作步驟:
 
  1.開機:接通電源,打開主機開關(guān),點燃(打開)光源后,根據(jù)說明書要求啟動計算機。
 
  2.檢測前準備:參照儀器說明書,在20天內(nèi)至少進行一次激發(fā)校準和發(fā)射校準,檢測前儀器應(yīng)預(yù)熱。
 
  3.工作條件的選擇:環(huán)境溫度應(yīng)在20℃±5℃;相對濕度不大于70%;電源穩(wěn)定,無磁場、電場干擾。根據(jù)樣品的特性及熒光強度,選擇合適的儀器工作條件(如狹縫、PM增益、響應(yīng)時間等)。
 
  4.基本測定
 
  (1)熒光激發(fā)光譜測定
 
  設(shè)置儀器參數(shù),掃描發(fā)射波長,找到maxλem,以此為發(fā)射波長,記錄發(fā)射強度作為激發(fā)波長的函數(shù),便得到激發(fā)光譜。
 
  (2)熒光發(fā)射光譜測定
 
  設(shè)置儀器參數(shù),掃描激發(fā)波長,找到maxλex,以此為激發(fā)波長,記錄發(fā)射強度與發(fā)射波長間的函數(shù)關(guān)系,便得到熒光發(fā)射光譜。
 
  (3)差譜測定
 
  設(shè)置儀器參數(shù),選擇合適的工作方式,測定背景溶液的發(fā)射光譜并儲存起來,在一定的工作方式下,掃描樣品溶液的發(fā)射波長,得到當時的光度值和儲存的背景值之間的差示值,即差譜。
 
  (4)峰面積積分
 
  選擇適當?shù)墓ぷ鞣绞?,對樣品溶液進行積分操作,即得到峰面積積分。
 
  (5)熒光強度
 
  選擇合適的測量參數(shù),設(shè)置λex、λem,采用定點讀數(shù)或掃描方式,即可測得所選波長處的熒光強度。
 
  (6)定量測定
 
  配制一系列已知濃度的標準溶液,在一定的測定條件下,設(shè)置λex、λem,按照由稀至濃的次序,測定標準溶液的熒光強度,繪制熒光強度—濃度的工作曲線,不改變儀器參數(shù)測定未知溶液的熒光強度,由工作曲線即可求出未知溶液的濃度。
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